案例解析

研究背景

山羊是一种重要家畜，其基因组序列对于农业和生物学研究非常重要。然而由于传统测序技术读长的限制，一直无法组装出高质量的参考基因组序列。本文通过利用多平台Pacbio+BioNano+Hi-C+Illumina多层级的组装策略，完成了高质量的山羊基因组序列组装。

研究策略

样本：6个品种的96只美国山羊，取其DNA血液，利用Illumina的Caprine53K SNP 芯片筛选出基因型纯和度最高的个体用来组装（San Clemente breed）。

研究结果

1.得到2.924 Gb的家山羊基因组，包含680个contig，contig NG50为18 Mb，scaffold NG50为87 Mb。组装完成的基因组只有649个gap，比之前的参考基因组连续400倍。

2.与之前发表的两个基因组版本CHIR_1.0、CHIR_2.0，通过各种参数比较发现，ARS1均优于之前版本，并且显著提升了重复序列区域组装效果。

3.通过比较发现，CHIR_2.0版本中的3,495个内含子或外显子有gap的基因，在ARS1中都得到补全。同时也确认1,926个预测的外显子在CHIR_1.0或者2.0中有gap，但在ARS1中得到修复。

4.由于免疫基因区高度多态性和重复性，用二代测序数据很难组装起来，但是通过分析发现，ARS1版本就很好地把LRC和NKC基因（免疫功能相关基因）定位在一个独立的常染色体scaffold上。

亮点

本文的研究策略会启迪后来的研究者，为de novo组装树立新标杆。Pacbio 测序技术联合多种scaffolding 平台（比如BioNano、Hi-C，mating-paired library，10X genomics）的使用，会引领de novo 组装进入 near finished genome 或者finished genome的新时代。

参考文献

Bickhart D M, Rosen B D,et al.Single molecule sequencing andconformational capture enable de novo mammalian reference genomes. BioRxiv,2016: 064352.

　结果展示　

基因组组装

组装结果评估

1. 序列一致性评估

在为了评估组装的准确性，选取一定量的测序数据与组装基因组比对，统计reads的比对率、覆盖基因组的程度以及深分布情况，由此评估组装的效果。

2. GC含量分析

组装的基因序列计算其GC含量和平均深度，根据此图分析测序数据是否存在GC偏向性以及样本是否存在污染。

　样本要求

　常见问题

1、如何评估研究物种的基因组大小？

（1）网站查询

查询植物基因组大小的网站：http://data.kew.org/cvalues

查询动物基因组大小的网站：http://www.genomesize.com

（2）流式细胞仪方法

流式细胞仪是目前比较常用的估计基因组大小的实验方法。

（3）Survey 评估

Survey分析，即将测序得到的 reads 打断成 K-mer，通过 K-mer 分析，从数学的角度评估基因组的大小，杂合以及重复等信息。并进行初步组装，从初步组装的 Contig 的 GC 分布图上，判断该物种是否有污染等信息，从而为后续组装策略的制定提供可靠的依据。

2、Survey和基因组de novo所用DNA是否需要一样的？

原则上Survey和de novo使用的DNA是来自一个个体的。如果DNA量不足以满足整个de novo项目，则建议小片段文库的DNA必须来自同一个体，三代大片段甚至超长片段的DNA文库使用同一群体的另一个个体。