QTL-Seq
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1、技术简介

QTL-seq: 通过选择目标性状存在极端表型差异的亲本杂交,构建子代分离群体,一般构建F2群体或RIL群体。在分离群体中,选择目标性状表型极端的一定数量个体分别混合成两个混池,对亲本及子代混池进行重测序,检测与目标性状关联的位点并注释,分析基因控制目标性状的机制。QTL-seq 主要用于有主效基因控制的数量性状的检测,且只能对单一性状进行检测。

2、技术路线

QTL-seq

3、分析内容        

分析内容

1、比对到参考基因组;

2、产出数据统计;

3、SNP检测、注释及统计;

4、子代混池SNP频率(SNP-index)分析;

5、候选区域计算;

6、候选位点的筛选与注释;

7、候选基因基因功能注释;

8、GO富集分析、KEGG通路分析;

4、方案设计

建库类型

350 bp插入片段文库;构建4个文库:

两个亲本分别建库,子代分别混池建库

测序类型

Novaseq,PE150测序

测序深度

每个亲本≥10X,每个子代混池≥30X

5、项目周期

样本数量

正常周期(天)

极致周期(天)

X≤100

45

(可协调)




 案例解析

基于QTL-seq方法鉴定西瓜矮杆基因

材料

由西瓜亲本dshI911构建的F2群体。(dsh的特点是蔓短、节间短、茎细、分支多,叶片、花、果实小)

文库构建

两个亲本单独建库;从F2群体中选取30株矮秆西瓜与30株正常西瓜,分别等量混池构成D-poolthe dwarf pool)、V-poolthe vine pool)。

测序平台

Illumina HiSeq4000,PE150测序

结果

1、得到了352,000SNPs97,186个多态性纯合SNP

D-poolV-pool2个混池的测序深度分别为45.94X39.62X,将测序数据与参考基因组比对,得到了352,000SNPs。用亲本dwarf的基因型作为参考序列,用2个混池的97,186个多态性纯合SNP进行分析,采用1M-10Kb的方式滑窗,计算平均的SNP-index。得到了2个混池的SNP-index曲线图,比较2个混池的SNP-index图得到了Δ (SNP-index)图。

2、注释得到了4个候选基因,提出基因Cla010726可能是西瓜中矮秆性状的候选基因

分析发现,7号染色体的27.66–30.61Mb区域的Δ (SNP-index)值显著偏离0,该区域为候选区域,对该区域进行基因注释得到了4个候选基因。发现基因Cla010726跟拟南芥的AtGA20ox1AtGA20ox2的相似度分别为30.50%29.60%。而GA20ox基因家族在很多植物中的作用是调节GA(赤霉素)的浓度。从而提出基因Cla010726可能是西瓜中矮秆性状的候选基因。

3、通过qRT-PCR的方法验证ClaGA20ox基因是造成西瓜矮化的主要原因之一

采用qRT-PCR的方式检测西瓜4个候选基因在2个亲本中的表达情况。发现基因Cla010726“I911”中的表达水平显著高于dsh植株(P < 0.05,进一步表明ClaGA20ox基因是造成西瓜矮化的主要原因之一。对F2群体中Cla010726基因启动子进行了测序,发现F2 dsh个体的Cla010726基因启动子部分含有2SNP

SNP指数图

图:SNP指数图(x轴表示七个染色体的位置,y轴表示SNP指数)

参考文献:

WeiD, Defeng W, Zicheng W. et al. Next-generation sequencing from bulked segregantanalysis identifies a dwarfism gene in watermelon. Scientific Reports . 2018,13;8(1):2908


 结果展示

1GO功能注释

GO(Gene Ontology, http://www.geneontology.org/)是基因本体论联合会建立的数据库,其目的在于标准化不同数据库中的关于基因和基因产物的生物学术语,对基因和蛋白功能进行限定和描述。利用GO数据库,可以将基因按照它们参与的生物学过程、构成细胞的组分,实现的分子功能等进行分类。将基因组所有基因及区域内关联基因分成两组进行GO注释的统计。

候选基因GO二级节点注释统计图

候选基因GO二级节点注释统计图

注:图中下方横坐标表示注释到某一GO term的基因个数,上方横坐标表示注释到某一GO term的基因数占所有有GO注释基因总数的比例(基因和GO term是多对多的关系,即一个基因可包含多个GO term的注释,某一个GO term 也会对应到多个基因,并不是一对一的关系);纵坐标表示GO的每一详细分类,三个方块分别代表GO的三个二级分类,分别为生物过程(Biological Process)、细胞组分(CellularComponent)、分子功能(Molecular Function);红色柱形代表所有基因,蓝色柱形代表区域内关联基因。

2KEGG注释

富集分析方法通常是分析一组基因在某个功能节点上是否出现过,原理是由单个基因的注释分析发展为基因集合的注释分析。富集分析提高了研究的可靠性,能够识别出与生物现象最相关的生物学过程。本次分析使用 KOBAS( http://kobas.cbi.pku.edu.cn/home.do ) 进行KEGG PATHWAY富集分析,计算原理同GO功能富集分析,使用Fisher精确检验进行计算。为控制计算假阳性率,采用BH(FDR)方法进行多重检验,计算公式与上节相同,经过校正的p值(Corrected P-Value)以0.05为阈值,满足此条件的KEGG通路定义为在差异表达基因中显著富集的KEGG通路。候选基因的KEGG通路富集分析结果见下图:

候选基因KEGG通路富集散点图

注:图中每个柱子为一个通路,横坐标文字表示通路的名称和分类,所属分类描述如左上角所示。柱子的高度即纵坐标表示富集率,计算公式如下:(EnrichmentRatio=SampleNumber/BackgroundNumber)。颜色表示富集的显著性即Pvalue,颜色越深表示该通路越显著富集,其中Pvalue<0.001的标记为***Pvalue<0.01的标记为** Pvalue<0.05 的标记为*,右侧颜色梯度表示Pvalue大小。

在生物体内,不同的基因产物相互协调来行使生物学功能,对关联基因的Pathway注释分析有助于进一步解读基因的功能。KEGGKyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)数据库(Kanehisa2015)是关于Pathway的主要公共数据库。

候选基因的KEGG通路注释图示意图

注:红色框标记的酶与关联基因有关,框内的数字代表酶的编号(EC number),而整个通路由多种酶催化的复杂生化反应构成,研究人员可以根据自己的研究对象间的差异,重点研究某些代谢通路相关基因的情况,通过通路解释表型差异的根源。

 样本要求

样品

具体要求

样品类型

无降解且无RNA污染的DNA样品

样品需求量

建议送样量:小片段文库≥2 µg;

最低送样量:小片段文库≥1 µg

构建多次(N次)文库所需DNA量:2×(N+1)µg

样品浓度

建议浓度:≥20 ng/µl

最低浓度:≥10 ng/µl

样品纯度

OD260/280=1.8~2.0


 常见问题 

1、为什么不直接用两个极端性状群体的混池测序找差异位点,却需要杂交一次?

回答:因为直接选用两个亲本个体或群体可能亲缘关系较远,除了导致性状差异的位点,还存在大量和所研究性状无关的差异位点。

2、复合性状是否适宜于QTL作图?

回答:与单一性状相比,复合性状受较多QTL控制、QTL具有更复杂的遗传效应(加性效应和互作效应)和连锁关系、QTL作图功效比构成性状下的功效明显下降,因此使用复合性状作图的意义不大。


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