RAD-Seq
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常见问题

1、技术简介

RAD-seq(Restriction-site Associated DNA sequencing)是基于酶切产生的基因组标签序列,进行简化基因组测序的技术。利用限制内切酶对基因组进行酶切,根据一定大小片段进行建库,对其进行高通量测序。RADseq不仅实验操作简单,性价比高,更为重要的是它并不依赖参考基因组的信息,一次测序即可获得数以万计的多态性遗传标记,已然广泛用于生态学、遗传学、基因组学等研究领域。

2、技术路线

RAD-seq

3、分析内容

4、方案设计

5、项目周期


 案例解析

1.生物的适应性

基于RADseq数据,利用GWAS和Fst outlier两种分析方法发现了与蝴蝶翅膀模式相关的loci,揭示了蝴蝶对生长环境的适应机制。

RADseq数据

2. 种群进化历史

三刺鱼不同种群的有效种群大小(Ne),并结合最小等位基因频谱,讨论9个地理种群可能经历的种群瓶颈事件。

RADseq数据

3) 群体结构

利用RAD-Tags的分析方法对蚊子的群体结构进行了探讨,发现基于SNP分型数据构建的系统谱系树与蚊子的生长环境基本对应,出现细微偏差的原因很可能在于蚊子生长环境的不同以及人为活动的干扰。


RAD-Tags的分析方法


参考文献

[1]Nicola J. Nadeau, Mayte Ruiz, PatricioSalazar, et al. Population Genomics of Parallel Hybrid Zones in the MimeticButterflies, H. Melpomene and H. Erato. Genome research, 2014. .

[2]Anne L. Ferchaud, Michael M. Hansen. TheImpact of Selection, Gene Flow and Demographic History on Heterogeneous GenomicDivergence: Threespine Sticklebacks in Divergent Environments.MolecularEcology, 2015. .

[3]Kevin J. Emerson, Clayton R. Merz, JulianM, et al. Resolving Postglacial Phylogeography Using High-ThroughputSequencing. PNAS, 2010..


8、结果展示

1遗传图谱结果

         共有XX个标记,总图距为XXcM,平均图距为XXcM。详见下表:

10 遗传图谱评估统计

Group

SNP_num

Bin_num

Genetic_distance(cM)

Average_distance(cM)

LG001





LG002





LG003





LG004






注:Average_distance(cM)=Genetic_distance(cM)/Bin_num

用MapDraw绘制连锁图,连锁群分布如下图。

         遗传连锁图谱

图 遗传连锁图谱

2、群体历史

群体历史主要关注物种在历史上的动态变化及其原因。群体历史研究内容包括物种历史有效群体大小,群体分化时间,群体间基因流三个方面。常与考古学和人文地理知识相结合。使用 DIYabc 软件( Gutenkunst et al., 2009)分析 XX 物种的群体历史。

XX物种的群体历史

XX物种的群体历史

注:纵坐标是群体发展的时间(单位:千年);有效群体大小用宽窄来表示,越宽表示有效种群大小越大;箭头表示基因流方向,箭头旁边的数字表示基因的迁移率,蓝色方框代表pop1,褐色代表pop2,灰色代表它们的祖先种。


 样本要求

样品

具体要求

样品类型

无降解且无RNA污染的DNA样品

样品需求量

建议送样量:小片段文库≥2 µg;

最低送样量:小片段文库≥1 µg

构建多次(N次)文库所需DNA量:2×(N+1)µg

样品浓度

建议浓度:≥20 ng/µl

最低浓度:≥10 ng/µl

样品纯度

OD260/280=1.8~2.0


 常见问题

1、RADseq的测序覆盖度要求?

回答:利用reference Mapping的方法进行的RADseq分析,在基因组完整程度较好的情况下,测序覆盖度的要求较低(<1x);而利用de novo分析则需要更深的测序覆盖度(10-20x)。

2、RADseq测序中Reads的长度?

回答:Long reads或者Pair-end reads在RADseq技术中拥有更多的优势,包括locus的识别度,旁系同源的污染排除,重复序列等等。尤其针对那些没有参考基因组且基因组重复序列比例较高的物种而言,Long reads和Pair-end reads优势更为明显。


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