MutMap
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常见问题

1、技术简介 

MutMap: 利用突变个体与亲本杂交构建家系群体,从分离群体(如F2 代)中选取一

定数量具有突变性状的个体构建混合池,对野生型亲本及子代混合池进行测序。计算

SNP-index 从而定位功能性突变位点。该方法多用于化学诱变或物理诱变引起的点突变

检测,在质量性状定位的研究中应用比较广泛。

2、技术路线 

MutMap

3、分析内容          

分析内容

1、比对到参考基因组;

2、产出数据统计;

3、SNP检测、注释及统计;

4、子代混池SNP频率(SNP-index)分析;

5、候选区域计算;

6、候选位点的筛选与注释;

7、候选基因基因功能注释;

8、GO富集分析、KEGG通路分析;

4、方案设计 

建库类型

350 bp插入片段文库;

野生型亲本单独建库,子代混池建库

测序类型

Novaseq,PE150测序

测序深度

亲本≥10X,子代混池≥30X

5、项目周期 

样本数量

正常周期(天)

极致周期(天)

X≤100

45

(可协调)


 案例解析 

文章题目:MutMap加速耐盐水稻品种的培育

材料

选取6000 株地方优良品种‘Hitomebore’,用EMS进行突变,从中选取耐盐突变株,命名为“hst1”

文库构建

亲本单独建库;从F2 中选取了20 株耐盐的个体,DNA 等量混成一个池

测序平台

Illumina GAIIx

结果

1、用MutMap的方法快速定位了耐盐相关基因OsRR22

MutMap分析生成的SNP-index,确定候选区间;通过将转座子Tos17插入突变体样本库,自交分离及基因型验证,发现耐盐为Tos17转座子纯合,敏感型为杂合或不含Tos17,说明Tos17转座子的插入导致OsRR22基因部分功能丧失。通过共分离验证,OsRR2功能缺失是突变体hst1获得耐盐性状的原因。

SNP-index图

2、培育出了耐盐新品种“kaijin

用突变株hst1Hitomebore回交,获得BC子代,在此基础上再自交2次,最终培育出Kaijin品种;该品种具有和突变体hst1相同的耐盐性,同时保留了Hitomebore优良的产量与品质性状。与传统育种约需10年时间相比,用MutMap方法大大缩短了育种时间。

参考文献

Takaqi H, Tamiru M, etal. MutMap accelerates breeding of a salt-tolerant rice cultivar. Nature

Biotechnology.2015 ;33(5):445-9.


 结果展示 

1、候选位点及候选区域分析

对开发所得到的SNP位点,进行亲本和突变混池的差异位点开发。计算每个差异的SNP位点的SNP-index值。index值指在混池中突变基因型在所有基因型中的深度比例,由于目标位点与周围标记的连锁效应,在目标位点的附近,index值更高,其余位点由于高通量测序的随机分布,应符合孟德尔分离。比例计算方法简述如下:

Index(Mut)=Depx/(DepX+Depx)

其中,DepxDepX分别为突变等位基因和非突变等位基因在Mutbulk中出现的reads数目。

MutMap SNP-index计算方法

MutMap SNP-index计算方法(Abe A et al., 2012)

为了消除假阳性的位点,利用标记在基因组上的位置,利用滑窗的方法将SNP index 值进行拟合,消除由于随机扩增导致的差异突变。

SNP-index在染色体上的分布均值

SNP-index在染色体上的分布均值。

根据计算机模拟实验计算结果,当置信度为0.99时,定位区域为xx-xxxxM)区间内,共得到xx个区域,总长度为xxbp,其中有xxgene

2、候选区域基因功能注释

通过BLASTAltschulS F, 1997)将候选区域内变异基因与NR Yangyang DENG, 2006),SwissProtGOAshburnerM, 2000),COGTatusovR L, 2000),KEGGKanehisa M, 2004)等功能数据库比对,得到这些基因的注释,用以分析基因功能。

在候选区域内,共注释到数据库xx个基因,各样品的具体统计结果见下表:

候选区域内基因注释统计表

注:

Annotateddatabases:功能注释数据库;

Gene Number:在相应数据库有注释信息的候选区域基因数;

Non_Syn GeneNum:候选区域内样品间存在非同义突变的基因数。


 样本要求 

样品

具体要求

样品类型

无降解且无RNA污染的DNA样品

样品需求量

建议送样量:小片段文库≥2 µg;

最低送样量:小片段文库≥1 µg

构建多次(N次)文库所需DNA量:2×(N+1)µg

样品浓度

建议浓度:≥20 ng/µl

最低浓度:≥10 ng/µl

样品纯度

OD260/280=1.8~2.0

 常见问题 

1、MutMap定位实验的必要条件是什么?

回答:1.一般为隐性突变,最好是EMS诱导的点突变;2.必须测野生型基因组3.必须有回交过程:纯合之后再与野生型回交,再自交得到F2。

2、SNP位点一般为两个等位基因,与参考基因组比较如何判断哪个碱基是突变的?

回答:如上述案例,作者利用重测序的方法,对野生型品种(Hitomebore)进行重测序,将read比对到参考基因组日本晴(Nipponbare )上,将Hitomebore和Nipponbare 之间的差异进行替换,得到Hitomebore的参考基因组,如果我们的突变型测序结果比对到Hitomebore参考基因组上,与参考基因组不同的碱基即为突变碱基。


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