案例解析　

文章题目：MutMap加速耐盐水稻品种的培育

材料

选取6000 株地方优良品种‘Hitomebore’，用EMS进行突变，从中选取耐盐突变株，命名为“hst1”

文库构建

亲本单独建库；从F2 中选取了20 株耐盐的个体，DNA 等量混成一个池

测序平台

Illumina GAIIx

结果

1、用MutMap的方法快速定位了耐盐相关基因OsRR22

由MutMap分析生成的SNP-index图，确定候选区间；通过将转座子Tos17插入突变体样本库，自交分离及基因型验证，发现耐盐为Tos17转座子纯合，敏感型为杂合或不含Tos17，说明Tos17转座子的插入导致OsRR22基因部分功能丧失。通过共分离验证，OsRR2功能缺失是突变体hst1获得耐盐性状的原因。

2、培育出了耐盐新品种“kaijin”

用突变株hst1与Hitomebore回交，获得BC子代，在此基础上再自交2次，最终培育出Kaijin品种；该品种具有和突变体hst1相同的耐盐性，同时保留了Hitomebore优良的产量与品质性状。与传统育种约需10年时间相比，用MutMap方法大大缩短了育种时间。

参考文献

Takaqi H, Tamiru M, etal. MutMap accelerates breeding of a salt-tolerant rice cultivar. Nature

Biotechnology.2015 ;33(5):445-9.

　结果展示　

1、候选位点及候选区域分析

对开发所得到的SNP位点，进行亲本和突变混池的差异位点开发。计算每个差异的SNP位点的SNP-index值。index值指在混池中突变基因型在所有基因型中的深度比例，由于目标位点与周围标记的连锁效应，在目标位点的附近，index值更高，其余位点由于高通量测序的随机分布，应符合孟德尔分离。比例计算方法简述如下：

Index(Mut)=Depx/(DepX+Depx)

其中，Depx和DepX分别为突变等位基因和非突变等位基因在Mutbulk中出现的reads数目。

图 MutMap SNP-index计算方法(Abe A et al., 2012)

为了消除假阳性的位点，利用标记在基因组上的位置，利用滑窗的方法将SNP index 值进行拟合，消除由于随机扩增导致的差异突变。

图 SNP-index在染色体上的分布均值。

根据计算机模拟实验计算结果，当置信度为0.99时，定位区域为xx-xx（xxM）区间内，共得到xx个区域，总长度为xxbp，其中有xx个gene。

2、候选区域基因功能注释

通过BLAST（AltschulS F, 1997）将候选区域内变异基因与NR（ Yangyang DENG, 2006），SwissProt，GO（AshburnerM, 2000），COG（TatusovR L, 2000），KEGG（Kanehisa M, 2004）等功能数据库比对，得到这些基因的注释，用以分析基因功能。

在候选区域内，共注释到数据库xx个基因，各样品的具体统计结果见下表：

表候选区域内基因注释统计表

注：

Annotateddatabases：功能注释数据库；

Gene Number：在相应数据库有注释信息的候选区域基因数；

Non_Syn GeneNum：候选区域内样品间存在非同义突变的基因数。

　样本要求　

　常见问题　

1、MutMap定位实验的必要条件是什么？

回答：1.一般为隐性突变，最好是EMS诱导的点突变；2.必须测野生型基因组3.必须有回交过程：纯合之后再与野生型回交，再自交得到F2。

2、SNP位点一般为两个等位基因，与参考基因组比较如何判断哪个碱基是突变的？

回答：如上述案例，作者利用重测序的方法，对野生型品种（Hitomebore）进行重测序，将read比对到参考基因组日本晴（Nipponbare ）上，将Hitomebore和Nipponbare 之间的差异进行替换，得到Hitomebore的参考基因组，如果我们的突变型测序结果比对到Hitomebore参考基因组上，与参考基因组不同的碱基即为突变碱基。