全外显子组测序
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1、技术简介                                                          

人类基因组中只有约1%的序列为蛋白质编码区(约30 Mb),而这些区域与上分布了目前已发现的85%致病突变。外显子组测序(Whole Exome Sequencing, WES)是利用含有人类全部外显子序列的探针杂交人类基因组DNA,特异性地获得蛋白质编码区的序列,并通过高通量测序技术发现与蛋白质功能改变密切相关的遗传变异的手段。

2、技术路线

                                                             

外显子组测序


3、分析内容                                                                     

标准分析内容

1、SNP检测,注释和统计

2、InDel检测,注释和统计

3、CNV检测及注释

4、变异全局统览

5、突变位点过滤

高级分析内容



肿瘤分析

1、LOH检测和注释

2、易感基因筛查

3、驱动基因分析

4、肿瘤突变负荷统计

5、肿瘤突变特征及突变频谱

5.1、肿瘤突变频谱

5.2、肿瘤突变特征谱

6、高频突变基因分析

6.1、高频突变基因统计

6.2、高频突变基因通路富集分析

7、高频拷贝数变异分析

8、高频突变基因靶向用药预测

单基因遗传病分析

1、基于样本信息的突变位点筛选

1.1、显性遗传突变分析

1.2、隐性遗传突变分析

1.3、新发突变分析

1.4、纯合子区域(ROH)分析

复杂疾病分析

1、疾病显著性关联位点分析

1.1、Fisher精确检验

1.2、绘制曼哈顿图

1.3、绘制Q-Q图

1.4、绘制Locus Zoom图

4、方案设计                                                            

建库类型

150-200 bp插入片段文库

测序类型

PE150测序

测序数据量建议

肿瘤研究——肿瘤≥100×

(推荐200×),癌旁100×;

单基因遗传病——100×;

复杂疾病——100×。

5、项目周期                                                                

样本数量

正常周期(天)

极致周期(天)

X≤50

30

20

X>50

30(需根据实际样本数评估)

20(需根据实际样本数评估)


案例解析                                                               

WES测序揭示肺癌早期进化模式[1]

背景介绍

肺癌是威胁人类健康的恶性肿瘤之一,非小细胞肺癌(NSCLC)是最常见的类型。英国政府在2014年启动了关于非小细胞肺癌的大型前瞻性临床研究(TrackingNon-Small-Cell Lung Cancer Evolution through TherapyTRACERx),意图从患者被诊断那一天开始采集患者的样本,分析患体内的基因变化,一直到患者死亡,探寻肿瘤异质性对治疗和预后的影响。该研究一共招募了842IA-IIIANSCLC患者,将肺癌组织分成不同的区域,对每个区域组织进行全外显子测序以探究癌组织内部的异质性。

材料

100名早期NSCLC患者(未经过系统治疗)癌组织的不同的区域(根据肿瘤发生部位的大小差异间隔0.3 cm – 1 cm取样),共取得327个肿瘤组织及100例配对血液,下图为100名患者的表型信息。

NSCLC研究队列患者表型信息汇总

1 NSCLC研究队列患者表型信息汇总

实验方案

建库方案:Agilent Human All Exome V5 kit (含额外增加的捕获区域:NSCLC ALKEML4FGFR1FGFR2FGFR3KIF5BNTRK1RETROS1TCF3这些基因中常见的基因融合事件)

测序平台:Illumina HiSeq 2500/ HiSeq 4000PE100

测序方法

肿瘤样本平均测序深度为431×83-986×),血液样本平均测序深度415×107-765×)。

结果

1. NSCLC肿瘤内的异质性

肿瘤内存在明显的异质性:点突变在肿瘤内异质性平均为30%,拷贝数变异的在肿瘤内异质性平均为48%,说明在肿瘤发展过程中,染色体的不稳定持续进行。亚克隆突变个数在2-2310个,受拷贝数影响的基因组的比例在0.06%-81%之间(图2)。

腺癌与鳞癌的比较:与腺癌相比,鳞癌患者会携带更多的克隆突变,而亚克隆突变在两者中并没有明显差异。腺癌中,肿瘤的恶性程度与亚克隆CNV比例具有正相关性;KI67染色(KI67作为标记细胞增殖状态的抗原)与克隆和亚克隆突变负荷以及亚克隆CNV的比例具有关联。吸烟腺癌患者携带更多的克隆和亚克隆突变,但这些现象并未在肺鳞癌患者中观察到(图2)。

非小细胞肺癌肿瘤样本中的基因异质性


2 非小细胞肺癌肿瘤样本中的基因异质性

亚克隆突变与肿瘤的复发和预后:亚克隆SNVInDel突变的比例与肿瘤的复发和预后并无明显关联,但亚克隆CNV比例却严重影响肿瘤的复发和预后,携带更多亚克隆CNV的患者更容易发生癌症的复发和死亡(图3)。

亚克隆突变与拷贝数变异和非小细胞肺癌患者死亡、复发之间的关系预测

3 亚克隆突变与拷贝数变异和非小细胞肺癌患者死亡、复发之间的关系预测

2.克隆与亚克隆驱动基因

驱动基因突变:总共发现了795个驱动基因突变事件,其中219个是亚克隆驱动基因突变,癌症基因的突变不仅只发生在克隆细胞上,还发生在基因组复制以前,说明这些基因参与了肿瘤的形成。

腺癌驱动基因:EGFRMETBRAF基因发生了突变和拷贝数变异,TERT发生了拷贝数变异。

鳞癌驱动基因:NOTCH1发生点突变,FGFR1SOX2PIK3CA基因发生了拷贝数变异。

随时间推移非小细胞肺癌中的基因突变事件

4 随时间推移非小细胞肺癌中的基因突变事件


结果展示                                                

标准分析部分内容展示

1.SNVInDel检测、注释与统计

SNV、InDel对编码基因的影响(上)和杂合性分析

5 SNVInDel对编码基因的影响(上)和杂合性分析(下)

单核苷酸变异(SNV)是研究人类家族遗传变异的重要依据,人基因组上平均每1000个核苷酸即可出现1个单核苷酸多态性的变化,是人类基因组上多态性最高的变异类型,其中有些单核苷酸多态性可能与疾病发生相关,但大多数与疾病无关。

基因组上小片段(<50 bp)的插入或者缺失(InDel),可以造成蛋白质编码区的移码突变,较大程度改变蛋白质的功能。对SNV以及InDel事件在基因组上的位置信息以及通过各类数据库进行注释,可以有效过滤无生物学意义或与表型无关的突变,缩小后续分析范围。


2. CNV检测、注释与统计

每条染色体外显子区的拷贝数变化汇总统计

6 每条染色体外显子区的拷贝数变化汇总统计

拷贝数变异(CNV)是由基因组发生重排而导致的,一般指长度1kb以上的基因组大片段的拷贝数增加或者减少,主要表现为亚显微水平的缺失和重复,会影响基因组的稳定性以及基因功能。目前的研究表明,CNV事件大多数与疾病有直接的因果关系,如老年痴呆、红斑狼疮、高血压、地中海贫血症等常见疾病均与基因组上的拷贝数异常相关。

                                         

高级分析部分内容展示

1.肿瘤突变特征及突变频谱

DNA 复制过程中的错配、内源或外源性诱变剂的诱导及 DNA 修复机制的缺陷等多种突变过程催生了肿瘤的体细胞突变,不同的突变过程产生特定的突变类型组合,即突变特征。对体细胞 SNV进行多角度分析,包括突变频谱(Mutation spectrum)和突变特征(Mutation signature)。从这些结果中可清晰了解癌症在点突变水平上的特征。通过突变频谱分析可以得知各个肿瘤样本各种类型突变的数量及样本是否有某种类型突变的偏好。通过分析体细胞突变特征,可以研究不同癌种的体细胞点突变特点。

肿瘤样本SNV突变特征以及突变频谱分析


7肿瘤样本SNV突变特征以及突变频谱分析[2]

2. 高频突变基因分析

高频突变基因(Significantlymutated genes, SMG)综合考虑了体细胞SNV InDel等变异事件,指突变频率显著高于背景突变频率(Backgroundmutation rate, BMR)的基因。这些基因可能会是肿瘤细胞中的关键驱动基因,结合后续对这些高频突变基因所在通路的富集,参考肿瘤细胞的表型,判断这些基因的突变事件在整个肿瘤发生、发展过程中扮演的角色。

高频突变基因汇总

8高频突变基因汇总[2]

3. 高频突变基因通路富集分析

   在生物体内,不同的基因可能协同或者互斥调控着细胞中的某些生物学过程。通过分析高频突变基因,可以找到哪些基因在肿瘤细胞的变化过程中起着关键的作用。进一步对这些基因所在通路进行富集,可以找到关键突变基因高频出现的通路,推测肿瘤细胞中因基因变异影响最大的生化代谢途径以及信号转导途径,与肿瘤细胞的表型相匹配并进行解释。

肿瘤细胞中高频突变基因通路富集

9 肿瘤细胞中高频突变基因通路富集[3]

9、参考文献

[1]Jamal-Hanjani M, Wilson GA, et al. Tracking the Evolution of Non–Small-CellLung Cancer[J]. N Engl J Med, 2017, 376: 2109-21.

[2] Scarpa A,Chang D K, Nones K, et al. Whole-genome landscape of pancreatic neuroendocrinetumours[J]. Nature, 2017, 543(7643):65.

[3] Zou S, LiJ, Zhou H, et al. Mutational landscape of intrahepatic cholangiocarcinoma[J].Nature Communications, 2014, 5:5696.


6、样本要求                                                           

样本总量与质量要求

送样建议

gDNA

普通样本提取gDNA

m≥3 μg

c≥30 ng/μL

无降解或者轻微降解

-80℃保存,干冰运输。

FFPE提取gDNA

m≥1 μg

c≥30 ng/μL

DNA片段≥250 bp

新鲜培养细胞

≥5×106 cell

离心收集细胞,并用PBS洗两次,放置干冰中速冻30 min,随后-80℃保存,干冰运输。

新鲜组织

≥50 mg

如果是活检组织,取黄豆大小2-3个,穿刺组织长度1 cm,2-3条

取出组织立即放置干冰中速��30 min,随后-80℃保存,干冰运输。

全血

≥1 mL

使用含有柠檬酸钠或EDTA为抗凝剂的采血管收集血液,缓慢颠倒10次充分混匀,-80℃保存,干冰运输。

FFPE

≥ 10片,未染色,100 mm2,5 ~ 10μm 厚度

提供多余一片进行HE染色,确定肿瘤细胞的含量(当下机数据大多数来自正常细胞时进行样本核查,建议客户送样前自行进行HE染色确定肿瘤含量,建议肿瘤含量>60%)

常温保存、运输。

l   将gDNA、细胞或者组织样本放置1.5 mL的离心管中,和样本信息单一一对应标记上样本名称。使用封口膜封住离心管,并放置在50 mL离心管(或其他容器)中,便于在干冰中寻找样本。

l   将样本放入合适的运输环境中,并尽快寄出,防止样本发生降解。避免假期前一日寄送样本,以免无人收样,导致样本降解。


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