全基因组甲基化测序
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1、技术简介               

DNA甲基化(DNAMethylation)是指在甲基转移酶的催化下,S-腺苷甲硫氨酸(SAM)上的甲基添加到DNA分子的碱基上的过程。胞嘧啶第5位碳原子和甲基的共价结合是常见的甲基化形式,胞嘧啶被修饰为5甲基胞嘧啶(5mC)。

目前,全基因组甲基化测序(WholeGenome Bisulfite Sequencing,WGBS)主要是通过重亚硫酸盐(Bisulfite)将基因组中未发生甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶,然后结合Illumina高通量测序平台,对全基因组范围内胞嘧啶的甲基化水平进行测定,精确分析每一个胞嘧啶的甲基化状态,从而构建全基因组甲基化图谱,进而探究胞嘧啶的甲基化在人类疾病、细胞生长发育过程中的重要机制。

2、技术路线


DNA甲基化

3、分析内容                         

数据分析

1. 深度和覆盖度分析

1.1 C碱基有效信息采集深度的累积分布

1.2 不同reads信息采集深度下的基因组覆盖度

2. C碱基的甲基化水平

2.1 C、CG、CHG和CHH平均甲基化水平

2.2 C碱基覆盖度分析

3. 全基因组甲基化水平分布趋势

3.1 甲基化C碱基中CG,CHG与CHH的分布比例

3.2 CG、CHG和CHH中的所有C的甲基化水平

3.3 各条染色体中CG、CHG和CHH中C的甲基化水平(只针对染色体信息齐全的物种)

3.4 统计不同基因区域内CG、CHG和CHH中C的甲基化水平

3.5 不同基因元件区域中CG、CHG和CHH中C的甲基化水平

3.6 CHG、CHH中甲基化C附近的9 bp序列的序列特征分析

4. 全基因组DNA甲基化图谱

4.1染色体水平的甲基化C碱基的密度分布(只针对染色体信息齐全的物种)

4.2 不同基因组区域的甲基化分布特征

4.3 基因组不同转录元件中的DNA甲基化水平

5. 差异性甲基化区域(DMR)分析(仅针对存在配对分析的样本)

5.1差异甲基化区域(DMRs)检测

5.2 DMR相关基因的GO功能显著性富集分析

5.3 DMR相关基因的Pathway显著性富集分析

4、方案设计                 

建库类型

300-400 bp插入片段文库

测序类型

PE150测序

测序数据量建议

90Gb的数据量,约30×

5、项目周期                   

样本数量

正常周期(工作日)

X≤10

45


案例解析                     

伯基特淋巴瘤和滤泡淋巴瘤的DNA甲基化分析鉴定与体细胞突变以及转录调控相关的甲基化区域

背景介绍

儿童期最常见的B细胞淋巴瘤是伯基特淋巴瘤/白血病,成年期最常见的是弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)和滤泡性淋巴瘤,它们都是由生发中心B细胞衍生,都表现出生发中心B细胞的分子特征。正常B细胞会从暗区或者亮区中心母细胞分化成为记忆细胞、浆细胞,或者凋亡,但是伯基特淋巴瘤和滤泡淋巴瘤似乎分别“冻结”在暗区和亮区生发中心B细胞状态。Burkitt淋巴瘤几乎总是与IG-MYC染色体易位相关。绝大多数滤泡性淋巴瘤携带t(14;18)(q32;q21)染色体易位。这些淋巴瘤亚型也显示出不同的二级变化谱,例如,细胞周期调节因子和ID3-TCF3转录因子复合物上的突变在伯基特淋巴瘤中非常普遍。

材料

13IG-MYC易位的伯基特淋巴瘤样本,9BCL2易位滤泡淋巴瘤样本,4个非肿瘤患者扁桃体的生发中心B细胞(control)。

测序平台

Illumina Human Methylation 450K BeadChip

测序方法

WGS30×

WGBS+RNA-seq54×

结果

1. Burkitt和滤泡淋巴瘤显示全基因组低甲基化

a.所有淋巴瘤与非肿瘤型生发中心B细胞相比都是低甲基化的;

b.虽然伯基特淋巴瘤和滤泡淋巴瘤来自相同的生发中心B细胞,但是甲基化水平存在比较明显的差异

d.启动子在全局水平上表现出最强的DNA甲基化水平

e.伯基特淋巴瘤和滤泡淋巴瘤启动子区甲基化水平增高,并且相关基因RNA表达提高


淋巴瘤中低甲基化
1 淋巴瘤中低甲基化


2. 启动子下游DNA甲基化与基因表达相关

分析肿瘤细胞相对正常对照的DMR:在滤泡性淋巴瘤中和正常对照有27,607DMR,在伯基特淋巴瘤中有36,775

b. 绝大多数DMR位于转录区域(TSSsTESs之间)

c.TSSs的下游DMR有很强的富集;

将基因内DMR的甲基化水平与包含这些DMR的相关基因的表达水平相关联

d. 40%的基因内DMR显示了甲基化与RNA表达之间的显著相关性(P < 0.05), 64%呈现负相关;

检测了先前报道的在生发中心的暗区或明区优先表达的基因:

f.g. h. 大约22%的暗区和28%的亮区特异性基因拥有DMR。暗区特异性基因在伯基特淋巴瘤中主要是低甲基化和上调,在滤泡性淋巴瘤中相反。

差异甲基化区域

2差异甲基化区域

3. DNA突变与鞘氨醇信号甲基化

S1PG蛋白信号的分析表明这些通路上的突变和DNA甲基化水平的差异在伯基特淋巴瘤协同影响癌症发生相关通路的正常功能。

在生发中心B淋巴瘤中,S1P受DNA突变和甲基化的影响

3在生发中心B淋巴瘤中,S1PDNA突变和甲基化的影响



结果展示                       

数据分析部分内容展示

1. 全基因组不同染色体上的甲基化胞嘧啶分布图

DNA甲基化水平的全局总览可以展示DNA甲基化的密度分布情况,通过分析会发现每条染色体上存在很大的密度差异。

不同染色体上甲基化胞嘧啶密度分布

图4 不同染色体上甲基化胞嘧啶密度分布

2. 甲基化胞嘧啶附近6 bp碱基序列特征分析

分析甲基化胞嘧啶附近的6bp的碱基分布情况,反映甲基化序列的特征,找到全基因组上甲基化胞嘧啶热点区域保守的motif序列。

分析思路:统计不同甲基化模式(CGCHGCHH)出现的概率。

分别表示CG,CHG,CHH附近的碱基分布特征

图5 分别表示CG,CHG,CHH附近的碱基分布特征

3. DMRs中甲基化水平分析

DMRs中的甲基化水平分析

6 DMRs中的甲基化水平分析,从左到右Sample1CGCHGCHH

注:最外圈表示基因组染色体的位置;第二圈为DMR区域,红色区域代表样品Sample1的甲基化水平高于样品Sample2,绿色区域表示样品Sample1的甲基化水平低于样品Sample2;第三圈表示样品Sample1各个位点的甲基化率;第四圈表示样品Sample2各个位点的甲基化率;第五圈表示甲基化率的差异程度。


4.差异区间(DMRs)相关基因功能富集

Gene ontologyGO)是所有物种中最主要的了解基因和基因产物属性的生物信息学分析手段。GO分析能够用于鉴定基因产物功能,主要分为三个类别:细胞组分(CellularComponent),分子功能(MolecularFunction)和生物学过程(BiologicalProcess)。将DMRs注释到各个基因元件(UpstreamexonintronDownstream)和功能调控区域(CpG岛,增强子以及重复序列区域),并对注释到的基因进行功能富集分析

变异全局总览DMR区域GO功能富集结果

    7变异全局总览DMR区域GO功能富集结果

KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes andGenomes)是有关Pathway的主要公共数据库,该数据库整合了基因组、化学以及系统功能信息,特别是测序得到的基因集与细胞、生物体以及生态环境的系统性功能相关联。所有样品中的DMR相关基因均用KEGG数据库进行分析。           

DMR区域KEGG功能富集结果

8   DMR区域KEGG功能富集结果


样本要求

样本总量与质量要求

送样建议

gDNA

普通样本提取gDNA

体积范围:15-100ul
总量:m>=2ug;

浓度:15ng/ul
完整性:无降解或轻微降解

-80℃保存,干冰运输





l   将gDNA放置1.5 mL的离心管中,和样本信息单一一对应标记上样本名称。使用封口膜封住离心管,并放置在50 mL离心管(或其他容器)中,便于在干冰中寻找样本。

l   将样本放入合适的运输环境中,并尽快寄出,防止样本发生降解。避免假期前一日寄送样本,以免无人收样,导致样本降解。


常见问题

Q:WGBS是否能区别5hmC和5mC?

A: 不能。5mC在TET家族酶氧化后产生5-羟甲基胞嘧啶(5hmC),可以调控基因表达,是一种重要的表观遗传修饰。

Q:WGBS与RRBS、MeDIP有什么差别?

方法

原理

优势

缺点

RRBS

(简化甲基化测序)

Msp1切割基因组,该酶的酶切位点为CCGG,选取一定长度的DNA建库,亚硫酸盐转化,扩增,测序

单碱基分辨率

聚焦CpG岛,测序数据量要求低

不能覆盖所有甲基化位点

MeDIP-sep

(甲基化DNA免疫共沉淀测序)

使用5mC抗体富集甲基化的DNA片段,建库,测序

起始量低

测序数据量要求低

覆盖所有甲基化位点

分辨率低

实验难做

WGBS

(全基因组甲基化测序)

全基因组DNA片段建库,亚硫酸盐转化,扩增,测序

单碱基分布率

覆盖所有甲基化位点

可同时获得基因组信息

数据量要求高

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