案例解析　

Liu MH, Yang BR,et al., Transcriptome analysis of leaves, roots and flowers of Panaxnotoginseng identifies genes involved in ginsenoside and alkaloid biosynthesis.BMC Genomics. 2015;16:265.

研究背景

三七是世界上最有价值的药用植物之一。主要的生物活性分子是三萜皂甙，也称为人参皂苷。然而，它庞大的基因组大小阻碍了整个基因组测序。因此，关于三七的基因组和转录组的细节，特别是其在植物不同部位的生物合成途径和基因表达，至今仍鲜为人知。材料和方法     

取材：三七的叶片、根、花文库：转录组文库

测序：HiSeq2000   PE100   

测序覆盖度≥130X

结果

1、通过对三七的不同组织（叶片、根、花）分别进行转录组测序，每个样品的测序数据量为5-8Gb

2、三个样本的reads 混合一起组装得到 205,000 个contigs,107,340 个 unigenes，他们的长度分别为781bp和1,039bp

3、616个unigenes 参与了多种次生代谢物的合成，其中参与苯丙素的合成和unigenes 是最多的，其次是萜类化合物骨架的生物合成

　结果展示　

转录本拼接

获得CleanReads后，我们使用Trinity（版本：v2.5.1，参数设置：minimum contiglength 200 bp, min glue 3, group pair distance 280, path reinforcement distance85, and min kmercovage 3，其余参数采用默认参数）进行转录本拼接，拼接的基本过程如下图所示：

图7 Trinity组装流程图

拼接得到的转录本序列信息以FASTA格式储存，如下所示：

图8转录本序列

其中大于号>后紧跟转录本序列的ID号，len=转录本长度，即该转录本的碱基数目，path为从deBruijn GraphsubComponent中经历的路径。其后为该转录本的序列。

样品基因表达量总体分布

通过所有基因的FPKM分布图和箱线图可以对不同实验条件下的样品表达水平进行比较。

图14 FPKM密度分布图

注：图中不同颜色的曲线代表不同的样品，曲线上点的横坐标表示对应样品FPKM的对数值，点的纵坐标表示概率密度。

我们可以从箱线图查看到单个样品基因表达水平分布的离散程度，也可以直观的比较不同样品的整体基因表达水平。该项目各样品的FPKM分布箱线图如下：

图15 FPKM箱线图

注：图中横坐标代表不同的样品；纵坐标表示样品表达量FPKM的对数值的排序结果。

此外针对样品的表达量数据也进行了主成分分析。PCA聚类图如下：

图16 PCA聚类图

差异表达作图

火山图可以直观的体现基因在两个样品(组)间表达水平的差异和及显著性。C-1_vs_B-1差异表达基因火山图如下：

图21 差异表达基因volcano图

图中每一点代表一个基因，横坐标为基因在样品间表达量差异倍数的对数值，纵坐标为基因表达量变化的统计学显著性的负对数值。横坐标绝对值越大，差异倍数越大；纵坐标值越大，差异表达筛选越可靠。图中红色方形点代表上调差异表达基因，蓝色圆形点表示下调差异表达基因，黑色三角形点表示非差异表达基因。

MA图可以直接体现基因在两个样品(组)间表达水平和差异倍数的整体分布。C-1_vs_B-1差异表达基因MA图如下：

图22 差异表达基因MA图

图中每一点代表一个基因，横坐标为log2(FPKM)，为两样品表达均值的对数值；纵坐标是基因在样品间表达量差异倍数的对数值，用于衡量差异大小。图中红色方形点代表上调差异表达基因，蓝色圆形点表示下调差异表达基因，黑色三角形点表示非差异表达基因。

对差异表达基因进行层次聚类分析，将具有相似或相同表达模式的基因进行聚类。差异表达基因聚类热图如下：

图23 差异表达基因聚类热图

横坐标代表样品名称及其聚类结果，纵坐标代表的差异基因及其聚类结果。图中不同的列代表不同的样品，不同的行代表不同的基因。颜色代表了基因在样品中的表达量水平。

差异表达基因数目统计

差异表达基因数目统计见下表：

表13 差异基因数目统计表

DEG: 差异组合；

total: 总的差异基因数目；

up: 上调差异基因数目；

down: 下调差异基因数目。

差异组合（差异组合数目：2~5组）韦恩图如下：

图24 差异组合间venn图

差异表达基因GO分析

差异表达基因GO功能分类统计图如下：

图25 差异表达基因GO分类统计图

注：横坐标为GO分类，纵坐标为基因数目.

根据实验目的筛选差异基因后，富集分析研究差异基因在GO中的分布情形以阐述实验中样本差异在基因功能上的体现。使用topGO[16]行富集分析，富集分析结果展示如下：

图26 差异表达基因topGO有向无环图(分子功能)

对每个GO节点进行富集，最显著的10个节点在图中用方框表示，图中还包含其各层对应关系。每个方框（或椭圆）内给出了该GO节点的内容描述和富集显著性值。不同颜色代表不同的富集显著性，颜色越深，显著性越高。对应于图25的富集结果(xls格式)如下：

表14 topGO富集结果(分子功能，部分)

GO.ID: GOTerm ID；

Term: GO Term名称；

Annotated: 注释到该GO Term的基因数目；

Significant: 注释到该GO Term的差异基因数目；

Expected: 注释到该GO Term的差异基因数目的期望值；

KS: Term富集显著性，值越小，表示富集越显著

差异表达基因KEGG pathway注释统计

在生物体内，不同的基因产物相互协调来行使生物学功能，对差异表达基因的通路（Pathway）

注释分析有助于进一步解读基因的功能。KEGG（Kyoto Encyclopediaof Genes and Genomes）数据库是关于代谢通路的主要公共数据库。

差异表达基因的通路注释结果示意见下图：

图28 差异表达基因的KEGG通路注释图

图中红色框标注的酶与上调差异基因有关；图中蓝色框标注的酶与上调和下调基因均有关；图中绿色框标注的酶与下调差异基因有关。

对C-1_vs_B-1差异表达基因KEGG的注释结果按照KEGG中通路类型进行分类，分类图如下图所示：

图29 差异表达基因KEGG分类图

注：纵坐标为KEGG代谢通路的名称，横坐标为注释到该通路下的基因个数。

差异表达基因蛋白网络互作

STRING[17]是收录多个物种预测的和实验验证的蛋白质-蛋白质互作的数据库，包括直接的物理互作和间接的功能相关。结合差异表达分析结果和数据库收录的互作关系对，构建差异表达基因互作网络。对于数据库中包含的物种，可直接从数据库中提取出目标基因集的互作关系对构建互作网络；对于数据库中未收录信息的物种，使用BLAST软件，将目的基因与数据库中的蛋白质进行序列比对，寻找同源蛋白，根据同源蛋白的互作关系对构建互作网络。构建完成的蛋白质互作网络可导入Cytoscape[18]软件进行可视化。Cytoscape可视化的差异表达基因蛋白质互作网络如下图：

图32 差异表达基因蛋白网络互作图

图中红色代表上调差异表达基因，天蓝色代表下调差异表达基因。

　样本要求　

1．RNA样品检测，是否可以提供检测的胶图？

RNA样品检测是用Agilent4200进行检测的，不进行跑胶，所以无胶图提供。

2．无参转录组与有参转录组的区别？

无参转录组需要首先对测序reads进行拼接，拼接后识别拼接结果中的可能转录本，最后对转录本进行功能注释，得到的注释基因多少与所研究的物种直接相关，如一些已有研究的物种，其功能较为清晰，得到的基因就会多；反之则会比较少。

3．无参转录组测序一般需要测多大的数据量？

测多少数据量需要结合研究目的和基因组大小来看，对绝大多数动植物来说8G的数据可以进行正常的生物信息分析。如果需要研究低丰度的转录本，或者想拼出一套比较完整的转录组，建议选10G 或更高的数据量。