案例解析　

Kim SK, Jung KH,et al., Changes in Bacillus anthracis CodY regulation under host-specificenvironmental factor deprived conditions. BMC Genomics.2016;17:645.

研究背景

炭疽杆菌，是炭疽热的病原菌。炭疽杆菌感染宿主的时候，宿主环境的改变，会诱导炭疽杆菌呈现不同的基因表达模式。CodY是一个起全局调控作用的转录因子，对炭疽杆菌的代谢、生物合成和毒性有重要的调节作用。作者通过转录组研究的方法，检测野生型和CodY 突变体在不同环境（Fe，CO2，葡萄糖）饥饿处理下的表达模式。发现有一些基因的表达不依赖于CodY，而一些基因的表达，在特定环境下，受CodY 的诱导/ 抑制。最后作者通过染色质免疫共沉淀，检测了那些可能受CodY 调控的基因，是否被CodY 结合。

材料与方法

材料：炭疽杆菌野生型和CodY 突变体，在全营养培养基，分别缺乏Fe、CO2、葡萄糖的培养基中培养。方法：转录组文库，HiSeq2000测序平台

结果

1、野生型和CodY 突变体，在不同环境饥饿处理下，基因表达模式都会发生改变。其中有一些基因只受环境调节，另一些受CodY 调节。

2、在铁饥饿环境下，铁稳态基因的表达与CodY 无关，而铁转运蛋白和氨基酸合成基因的表达依赖于CodY的调节。

　结果展示　

差异表达作图

火山图可以直观的体现基因在两个样品(组)间表达水平的差异和及显著性。C-1_vs_B-1差异表达基因火山图如下：

图21 差异表达基因volcano图

图中每一点代表一个基因，横坐标为基因在样品间表达量差异倍数的对数值，纵坐标为基因表达量变化的统计学显著性的负对数值。横坐标绝对值越大，差异倍数越大；纵坐标值越大，差异表达筛选越可靠。图中红色方形点代表上调差异表达基因，蓝色圆形点表示下调差异表达基因，黑色三角形点表示非差异表达基因。

MA图可以直接体现基因在两个样品(组)间表达水平和差异倍数的整体分布。C-1_vs_B-1差异表达基因MA图如下：

图22 差异表达基因MA图

图中每一点代表一个基因，横坐标为log2(FPKM)，为两样品表达均值的对数值；纵坐标是基因在样品间表达量差异倍数的对数值，用于衡量差异大小。图中红色方形点代表上调差异表达基因，蓝色圆形点表示下调差异表达基因，黑色三角形点表示非差异表达基因。

对差异表达基因进行层次聚类分析，将具有相似或相同表达模式的基因进行聚类。差异表达基因聚类热图如下：

图23 差异表达基因聚类热图

横坐标代表样品名称及其聚类结果，纵坐标代表的差异基因及其聚类结果。图中不同的列代表不同的样品，不同的行代表不同的基因。颜色代表了基因在样品中的表达量水平。

差异表达基因数目统计

差异表达基因数目统计见下表：

表13 差异基因数目统计表

DEG: 差异组合；

total: 总的差异基因数目；

up: 上调差异基因数目；

down: 下调差异基因数目。

差异组合（差异组合数目：2~5组）韦恩图如下：

图24 差异组合间venn图

差异表达基因GO分析

差异表达基因GO功能分类统计图如下：

图25 差异表达基因GO分类统计图

注：横坐标为GO分类，纵坐标为基因数目.

根据实验目的筛选差异基因后，富集分析研究差异基因在GO中的分布情形以阐述实验中样本差异在基因功能上的体现。使用topGO^[16]行富集分析，富集分析结果展示如下：

图26 差异表达基因topGO有向无环图(分子功能)

对每个GO节点进行富集，最显著的10个节点在图中用方框表示，图中还包含其各层对应关系。每个方框（或椭圆）内给出了该GO节点的内容描述和富集显著性值。不同颜色代表不同的富集显著性，颜色越深，显著性越高。对应于图25的富集结果(xls格式)如下：

                                                          表14 topGO富集结果(分子功能，部分)

GO.ID: GOTerm ID；

Term: GO Term名称；

Annotated: 注释到该GO Term的基因数目；

Significant: 注释到该GO Term的差异基因数目；

Expected: 注释到该GO Term的差异基因数目的期望值；

KS: Term富集显著性，值越小，表示富集越显著

差异表达基因KEGG pathway注释统计

在生物体内，不同的基因产物相互协调来行使生物学功能，对差异表达基因的通路（Pathway）

注释分析有助于进一步解读基因的功能。KEGG（Kyoto Encyclopediaof Genes and Genomes）数据库是关于代谢通路的主要公共数据库。

差异表达基因的通路注释结果示意见下图：

图28 差异表达基因的KEGG通路注释图

图中红色框标注的酶与上调差异基因有关；图中蓝色框标注的酶与上调和下调基因均有关；图中绿色框标注的酶与下调差异基因有关。

对C-1_vs_B-1差异表达基因KEGG的注释结果按照KEGG中通路类型进行分类，分类图如下图所示：

图29 差异表达基因KEGG分类图

注：纵坐标为KEGG代谢通路的名称，横坐标为注释到该通路下的基因个数。

差异表达基因蛋白网络互作

STRING^[17]是收录多个物种预测的和实验验证的蛋白质-蛋白质互作的数据库，包括直接的物理互作和间接的功能相关。结合差异表达分析结果和数据库收录的互作关系对，构建差异表达基因互作网络。对于数据库中包含的物种，可直接从数据库中提取出目标基因集的互作关系对构建互作网络；对于数据库中未收录信息的物种，使用BLAST软件，将目的基因与数据库中的蛋白质进行序列比对，寻找同源蛋白，根据同源蛋白的互作关系对构建互作网络。构建完成的蛋白质互作网络可导入Cytoscape^[18]软件进行可视化。Cytoscape可视化的差异表达基因蛋白质互作网络如下图：

图32 差异表达基因蛋白网络互作图

图中红色代表上调差异表达基因，天蓝色代表下调差异表达基因。

　样本要求　

1．物种没有参考基因组，可以做原核转录组分析吗？

不可以。原核转录组要求有参考基因组，因为原核生物的mRNA一般为多顺反子，直接拼接效果较差，无法准确确定基因的起始终止位置。

2．原核生物与真核生物在进行转录组测序文库构建时有什么区别？

在原核生物中，mRNA只占全部RNA的1-5%，其余绝大部分是核糖体RNA（rRNA），原核生物并不像真核生物mRNA具有polyA的结构，所以无法直接利用oligoT将mRNA纯化出来，如果直接使用total RNA进行测序，那么测序效率会非常低，因为大部分的序列都来自rRNA。目前，提高原核生物中mRNA的量，最主要的方式是去除total RNA中rRNA。

3．rRNA 去除方法？

原核mRNA一般不具有polyA结构，这类不具有polyA结构的转录组样品，一般采用rRNA探针法特异性去除rRNA。