LncRNA测序
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1、技术简介

长链非编RNAlongnon-codingRNA,LncRNA)是一类转录本长度超200nt编码蛋白RNA。利用新一代高通量测序技术进lncRNA,并结合生物信息学的预测工具进lncRNA,有助于科研工作者更快发现那些具有重要调控功能lncRNA,分析其与特定生物学过程的关。该方法可以更加高效地获lncRNA列以及位置信,且突破了常lncRNA芯片检测技术的使用范围限,还可对新的lncRNA进行预测及功能分析,极大促进lncRNA的深入研究。

2、技术路线

长链非编码RNA

3、分析内容

分析内容

分析条款

备注

数据质控

1、测序数据过滤和质量评估(过滤过程中去除核糖体rRNAtRNA序列)


2、比对参考序列(比对统计、测序随机性评估、比对上序列在染色体的分布、比对上序列在基因区域的分布、比对结果可视化)

标准分析

1mRNA分析


1.1mRNA的表达量估计(表达量分布,样品聚类)


1.2、差异表达分析(差异表达基因聚类图, 蛋白网络互作)


1.3、差异基因GOKEGG功能注释


2、转录本拼接


3、可变剪切分析


3.1、可变剪接预测


3.2、新转录本预测


4、变异分析


5novel lncRNA鉴定


6lncRNA特征分析(lncRNA长度分布统计,外显子个数分布统计,mRNAlncRNA特征比较


7lncRNA表达水平分析


7.1lncRNA表达量估计(表达量分布,样品实验聚类)


7.2lncRNA差异表达分析(有分组)


8lncRNA功能分析


8.1lncRNA靶基因的GOKEGG功能注释


8.2lncRNACis作用靶标预测及功能注释


8.3lncRNATrans靶标预测及功能注释(预测方法:LncTar


8.4、差异lncRNA与靶基因调控网络分析


4、方案设计

建库类型

链特异性文库

测序类型

NovaseqPE150测序

测序数据量建议

一般测序:10Gb/   样本;深度测序:20Gb/   样本

5、项目周期

样本数量

正常周期(天)

极致周期(天)

X≤24

55

30

备注:极致周期需向销售总监申请,批准后与项目管理部进行协调,方可执行极致周期


 案例解析 

Liu Y, Sun Y, etal., Analyses of Long Non-Coding RNA and mRNA profiling using RNA sequencing inchicken testis with extreme sperm motility. Sci Rep. 2017;7(1):9055.

研究背景

精子运动是评价公鸡生育力的最重要指标。然而,鸡精子运动的基因机制尚不清楚。长链非编码RNA(lncRNA)在生殖中发挥重要的表观遗传作用。

材料和方法

6 个北京本地公鸡的睾丸RNA(3 个强活力精子 H1H2H33个低活力精子L1L2L3)构建链特异性文库测序。

1、在鸡睾丸中鉴定了2597 LncRNA, 其中包括 1267 个大的基因间长链非编码RNAs(lincRNAs) , 975个反义 lncRNAs355个内含子lncRNAs。这些 lncRNAs 中有124 个是差异表达的。

2、鉴定了17690 mRNAs544个是差异表达,包括在精子运动中一些已知功能的mRNAs

3、鸡的9 lncRNA 29 个人的lncRNA 重叠,和 14 个小鼠的lncRNA 重叠,此外,5 lncRNAs与人类和小鼠重叠。

4、发现了1525 lncRNA 基因位点被转录到它们的临近的编码蛋白质中(< 100 kb),总共有1,895 个编码蛋白质。在这些临近的编码蛋白质中,有1611 个被分配到15 GO 富集的生物过程中( 富集基因> 10),主要是信号转导和转录调控。


 结果展示 

mRNAlncRNA长度比较分析

mRNAlncRNA的长度、ORF长度等进行比较可以了解两者之间的结构、序列等方面的差异。

分别对mRNAlncRNA的长度分布进行统计,统计图如下

mRNA长度分布统计图

42mRNA长度分布统计图

lncRNA长度分布统计图

43lncRNA长度分布统计图

mRNAlncRNAORF长度比较分析

mRNA和筛选得到的lncRNA进行ORF预测,并统计其长度分布。统计图如下:

mRNA的ORF长度分布统计图

44mRNAORF长度分布统计图

lncRNA的ORF长度分布统计图

45lncRNAORF长度分布统计图

mRNAlncRNA表达水平比较分析

通过对所有转录本的FPKM箱线图对mRNAlncRNA的表达水平进行比较分析,如下图:

lncRNA和mRNA表达量比较图

46lncRNAmRNA表达量比较图

注:横坐标为分子类型,纵坐标为log10FPKM+1);盒形图统计至上而下分别为最大值,上四分位数,中指,下四分位数,和最小值

mRNAlncRNA可变剪接异构体比较分析

mRNA与筛选到的lncRNA的可变剪切异构体个数进行比较,如下图:

mRNA与筛选到的lncRNA的可变剪切异构体个数统计图

47mRNA与筛选到的lncRNA的可变剪切异构体个数统计图


 样本要求 

样品

具体要求

样品类型

细胞、新鲜组织或 RNA 样品

样品需求量

细胞样品请提供至少 1×107 个细胞,组织样品请提供至少 300mg 的组织块或切片, RNA 样品请提供 2 μg 以上的总 RNA

样品浓度

建议浓度:≥ 500 ng/μl

样品纯度

RNA 无明显降解,提取的总RNA OD260/280 值在 1.8~2.2 之间,28S:18S ≥ 1.5RIN ≥ 7


1.什么是长链非编码 RNA?以及它们的作用?

哺乳动物基因组序列的约 5%~10%被稳定转录,蛋白质编码基因仅约占 1%,其余 4%~9%的序列都转录为非编码 RNA。而非编码 RNA(non-coding RNA) 是指不能翻译为蛋白的功能性 RNA 分子。长链非编码 RNA 为这4%~9%中长度大于 200nt 的非编码 RNA。它们的作用主要体现在四个方面:第一,影响周边基因的表达;第二,调控蛋白质活动及定位;第三,产生小分子 RNA;第四,对其他 RNA 的调控作用。

2.LncRNA建库的样本投入量是多少?是否可以进行低起始量的建库?

目前lncRNA的建库样本起始量默认为1ug。在样本完整度较高的情况下,最低可进行100ng样本起始量的建库,但低投入量的文库存在遗漏某些较低丰度转录本的风险,且文库的duplication也会相应上升。因此,在客观条件允许的情况建议尽可能的满足常规建库起始量的要求。

3.目前有哪些物种可以进行lncRNA测序?

目前使用的核糖体去除试剂盒,可对包括人、大鼠、小鼠在内的部分动物,大部分植物进行lncRNA建库测序。如您的研究物种较为特殊,可与我们沟通制定方案。

4.lncRNA 测序分析是否需要参考基因组?

需要,目前只对有参考基因组的物种进行 long non-coding RNA 分析。


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