案例解析　

Liu Y, Sun Y, etal., Analyses of Long Non-Coding RNA and mRNA profiling using RNA sequencing inchicken testis with extreme sperm motility. Sci Rep. 2017;7(1):9055.

研究背景

精子运动是评价公鸡生育力的最重要指标。然而，鸡精子运动的基因机制尚不清楚。长链非编码RNA(lncRNA)在生殖中发挥重要的表观遗传作用。

材料和方法

6 个北京本地公鸡的睾丸RNA(3 个强活力精子 H1、H2、H3，3个低活力精子L1、L2、L3）构建链特异性文库测序。

结果

1、在鸡睾丸中鉴定了2597 个LncRNA, 其中包括 1267 个大的基因间长链非编码RNAs(lincRNAs) , 975个反义 lncRNAs，355个内含子lncRNAs。这些 lncRNAs 中有124 个是差异表达的。

2、鉴定了17690 个 mRNAs，544个是差异表达，包括在精子运动中一些已知功能的mRNAs。

3、鸡的9 个lncRNA 和 29 个人的lncRNA 重叠，和 14 个小鼠的lncRNA 重叠，此外，5 个lncRNAs与人类和小鼠重叠。

4、发现了1525 个lncRNA 基因位点被转录到它们的临近的编码蛋白质中(< 100 kb)，总共有1,895 个编码蛋白质。在这些临近的编码蛋白质中，有1611 个被分配到15 个GO 富集的生物过程中( 富集基因> 10)，主要是信号转导和转录调控。

　结果展示　

mRNA和lncRNA长度比较分析

对mRNA和lncRNA的长度、ORF长度等进行比较可以了解两者之间的结构、序列等方面的差异。

分别对mRNA和lncRNA的长度分布进行统计，统计图如下：

图42mRNA长度分布统计图

图43lncRNA长度分布统计图

mRNA和lncRNA的ORF长度比较分析

对mRNA和筛选得到的lncRNA进行ORF预测，并统计其长度分布。统计图如下：

图44mRNA的ORF长度分布统计图

图45lncRNA的ORF长度分布统计图

mRNA和lncRNA表达水平比较分析

通过对所有转录本的FPKM箱线图对mRNA与lncRNA的表达水平进行比较分析，如下图：

图46lncRNA和mRNA表达量比较图

注：横坐标为分子类型，纵坐标为log10（FPKM+1）；盒形图统计至上而下分别为最大值，上四分位数，中指，下四分位数，和最小值。

mRNA和lncRNA可变剪接异构体比较分析

对mRNA与筛选到的lncRNA的可变剪切异构体个数进行比较，如下图：

图47mRNA与筛选到的lncRNA的可变剪切异构体个数统计图

　样本要求　

1．什么是长链非编码 RNA？以及它们的作用？

哺乳动物基因组序列的约 5%～10%被稳定转录，蛋白质编码基因仅约占 1%，其余 4%～9%的序列都转录为非编码 RNA。而非编码 RNA(non-coding RNA) 是指不能翻译为蛋白的功能性 RNA 分子。长链非编码 RNA 为这4%～9%中长度大于 200nt 的非编码 RNA。它们的作用主要体现在四个方面：第一，影响周边基因的表达；第二，调控蛋白质活动及定位；第三，产生小分子 RNA；第四，对其他 RNA 的调控作用。

2．LncRNA建库的样本投入量是多少？是否可以进行低起始量的建库？

目前lncRNA的建库样本起始量默认为1ug。在样本完整度较高的情况下，最低可进行100ng样本起始量的建库，但低投入量的文库存在遗漏某些较低丰度转录本的风险，且文库的duplication也会相应上升。因此，在客观条件允许的情况建议尽可能的满足常规建库起始量的要求。

3．目前有哪些物种可以进行lncRNA测序？

目前使用的核糖体去除试剂盒，可对包括人、大鼠、小鼠在内的部分动物，大部分植物进行lncRNA建库测序。如您的研究物种较为特殊，可与我们沟通制定方案。

4．lncRNA 测序分析是否需要参考基因组？

需要，目前只对有参考基因组的物种进行 long non-coding RNA 分析。