CircRNA测序
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1、技术简介

环状RNA(circRNA) 是一类特殊的非编码RNA 分子,也是RNA 领域最新的研究热点。与传统的线性RNAlinearRNA53末端不同circRNA分子呈封闭环状结构,RNA外切酶影,表达更稳,不易降。近几年的研究表明,circRNA在生物的生长发育、对外界环境的抵御等方面具有重要的调控作用。由于circRNA 的闭合环状,通过去totalRNArRNA和线RNA,可以特异地富circRNA子后测序利用高通量测序技术可鉴定circRNA在生物样本中的种类表达丰度及结构,circRNA 研究的发,更有针对性地分析受检样本中特定circRNA 谱、circRNA剪接模式、组间差异和功能等。

2、技术路线


环状RNA(circRNA)

3、分析内容   

分析内容

分析条款

备注

数据质控

1、对原始数据进行去除低质量、去除接头等处理得到备用的序列


标准分析

1、长度分布统计:统计miRNA的长度分布;


2、基因组比对:将clean reads定位到参考基因组序列上面(需要基因组参考序列)


3、已知miRNA鉴定:与miRBase   21中指定范围的miRNA比对


4、公共及特有序列分析;


5、非编码RNA比对:与Rfam   12.0中的序列进行比对,鉴定各类非编码RNA


6novel miRNA预测:对未注释的序列进行novel   miRNA预测


7miRNA结构水平分析:碱基偏好性分析,碱基编辑分析;


8miRNA表达量水平分析:表达量统计、差异分析和聚类分析


9miRNA功能分析:miRNA靶基因预测和靶基因的功能注释分析


4、方案设计

建库类型

链特异性文库

测序类型

NovaseqPE150测序

测序数据量建议

推荐 10 Gb/ 样本

5、项目周期

样本数量

正常周期(天)

极致周期(天)

X≤12

60

52

备注:极致周期需向销售总监申请,批准后与项目管理部进行协调,方可执行极致周期


 案例解析 

Zheng Q, Bao C,et al., Circular RNA profiling reveals anabundant circHIPK3 that regulates cellgrowth by sponging multiple miRNAs. Nat Commun. 2016;7:11215.

研究背景

环状RNA(CircRNAs) 是一种广泛且多样性的内源性 RNA,可调节真核生物的基因表达。然而,人类CircRNA的调控和功能在很大程度上仍是未知的。

材料和方法

材料:6个正常组织(脑、心脏、肝脏、结肠、肺和胃)和7 个肿瘤组织(膀胱癌、乳腺癌、结直肠癌、肝癌、胃癌、肾癌、前列腺癌)进行circRNA mRNA 测序

方法:链特异性文库HiSeq 2000 PE100 测序

1、作者共鉴定得到27296 circRNA 分子,且80% 以上的circRNA 来源于外显子区域,长度主要分布在 300-500bp,在不同组织中具有特异的表达模式。

2、分析发现单个基因可以产生多个circRNA,通常是 2-6 circRNA,也有多于 16 个的,这说明circRNA的形成及种类非常复杂,但同一基因来源的circRNA 也存在优势表达的亚型种类。

3circRNA侧翼内含子的长度与其表达丰度相关,高表达的circRNA 侧翼内含子序列较长。

4、比较线性及对应的circRNA 表达差异时发现,circHIPK3 表达量比其相应的线性RNA 表达量高很多,预示着circHIPK3 在肿瘤细胞中起到重要的作用。

circHIPK3 进行功能研究发现,circHIPK3 通过与miR-124 结合来逆转 miR-124 对其靶基因的调控作用。


 结果展示 

CIRCexplorer识别CircRNA

CIRCexplorerZhang et al.,2014)是一种通过Back-splicedJunction Reads来注释环状RNA的软件。基于上述基本思想,CIRCexplorer首先将所有Clean Reads利用TopHat2Trapnell et al.2009)软件与参考基因组比对,无法比对上的Reads再利用TopHat-Fusion进一步比对工作原理示例图如下:

CIRCexplorer工作原理  识别出的CircRNA

9CIRCexplorer工作原理

识别出的CircRNA交集

由于circRNA本身的难以使用信息分析手段准确的检测出来,并且不同比对方法识别出的circRNA也会有一定差距,研究表明在众多circRNA识别软件中取两款软件识别的circRNA 交集得到的结果在保证识别出的 circRNA一定量的前提下能有效降低假阳性率(Hansenet al. 2015)。因此在我们的分析流程中我们选择了CIRCexplorerCIRI两款软件识别出的circRNA的交集作为识别出的circRNA用于后续分析。circRNA的识别结果见下表所示:

5circRNA识别统计表

CircRNA ID

Circ_1: 805799|810170

Chr

1

Start

1223244

End

1223968

Type

mRNA

Strand

-

KnownID

-

GeneID

ENSG00000078808

Gene Type

Protein_coding

JuncReads

5

CircRNA统计结果

为了了解环状RNA在染色体上的分布,我们统计了环状RNA的起始点和终止点在染色体上的分布情况,其中柱子的高度表示该位置的深度,结果如下图所示:

circRNA在染色体上分布图

11circRNA在染色体上分布图

注:横线表示染色体,纵坐标表示对应位置的深度。

环状RNA的外显子个数峰值通常在2-3个位置处,根据环状RNA包含的外显子个数做出如下统计柱状图:

12circRNA在exon处发现频率分布图

12circRNAexon处发现频率分布图

注:横坐标表示外显子个数,纵坐标表示对应外显子个数的环状RNA个数。

将识别到的circRNAcircbaseGlažar et al.2014)数据库中的circRNA作比较,并对数据库中已有的和没有的circRNA进行统计,统计结果见下表:

6已知circRNA统计表

Sample

Control

Known circRNA

1560

Novel circRNA

1390

Total circRNA

2950

Known circRNA Rate (%)

52.88

CIRI识别CircRNA

CIRICircRNA Identifier Gao et al. 2015)利用BWA-MEMLi H. 2013)算法进行序列比对,寻找Junction Reads,然后根据支持剪切切位点的GT-AG信号的Junction Reads作为识别circRNA的依据,利用动态规划算法(DynamicProgramming)来检测circRNACIRI检测circRNA原理见下图:

CIRI工作原理

10CIRI工作原理


 样本要求 

样品

具体要求

样品类型

无降解且无RNA污染的DNA样品

样品需求量

建议送样量:小片段文库≥2 µg

最低送样量:

构建多次(N次)文库所需DNA量:N+1µg

样品浓度

建议浓度:≥30 ng/µl

最低浓度:

样品纯度

OD260/280=1.8~2.0


1.没有参考基因组是否能做CircRNA呢?

答:在CircRNA预测时,测序clean reads需要与参考基因组比对,得到准确的成环剪接位点(breakpoint);如果没有参考基因组或者只有无参转录组得到的Unigene,可能会由于拼接错误等造成CircRNA预测不准确,所以为了得到准确的分析结果,需要选择有参考基因组物种进行分析。

2.环状RNA的生物功能有哪些?

① 竞争性内源RNA。circRNA富含miRNA结合位点来充当miRNA海绵作用,阻止miRNA在3′非翻译区与mRNA相互作用,进而间接调控miRNA下游靶基因的表达。

② 调控蛋白结合。circRNA通过与mRNA调节的结合蛋白(RBP)结合,进而改变剪接模式或mRNA稳定性。

③ 调控基因转录。circRNA与RNA聚合酶相互作用并调节转录。

④ 编码功能。circRNA虽然属于非编码RNA,但也有部分circRNA可被核糖体翻译并编码多肽,进而行使调控功能。

3.为什么做cricRNA 需要的total RNA量更大?


circRNA 测序对 total RNA 的要求与普通的 RNA-seq 相同,所以抽提方法也相同。但是由于 circRNA 建库需要去除 rRNA 和线性 RNA,所以需求大量的 total RNA,需提供 ≥22 μg的 total RNA,其中 20 μg 用于 circRNA 建库。


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