变异检测
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常见问题

1、技术简介

变异检测是指通过高通量测序技术对某一物种个体或群体的基因组进行测序及差异分析,获得大量的遗传变异信息,如单核苷酸多态性(SNP)、插入缺失(InDel)、结构变异(SV)、拷贝数变异(CNV)等,可用于开发分子标记,建立遗传多态性数据库,为后续揭示进化关系、挖掘功能基因、辅助分子遗传育种等奠定数据基础。

2、技术路线

                 

               基因组DNA

3、分析内容


全基因组重测序(WGS)

简化基因组测序(GBS)

分析内容

1)去除接头污染和低质量数据;

2)比对到参考基因组;

3)产出数据统计;

4)SNP检测、注释及统计;

5)InDel检测、注释及统计;

6)SV检测、注释及统计;

7)CNV检测、注释及统计;

8)变异全局总览

1)去除接头污染和低质量数据;

2)比对到参考基因组;

3)产出数据统计;

4)SNP检测、注释及统计;

4、方案设计


全基因组重测序(WGS)

简化基因组测序(GBS)

建库类型

350bp插入片段文库

EcoRI、MseI单酶和组合酶切文库

测序类型

PE150测序

PE150测序

测序数据量建议

SNP/InDel≥10X
   SV≥20X、CNV≥30X

Tag数≥10万
平均8X/Tag

5、项目周期

样本数量

项目周期(天)

极致周期(天)

X≤10

40


10<X<20

45




 案例解析 

辐射突变的水稻的全基因组分析

背景介绍

辐射诱变已经成功地应用于植物(例如,水稻和玉米)进行种质创新。辐射诱变通过改变染色体数目、染色体结构或核苷酸组成从而引起表型改变。全基因组测序(WGS)能够检测突变个体全基因组范围内的变异,为识别辐射诱变的全基因组范围内的变异提供了手段。

材料

Red-1,由水稻9311经过辐射诱变产生的红色谷皮水稻

测序平台

Solex测序平台

结果

1、测序得到了9.41Gb的cleandata,测序深度为22.84X。Red-1基因组序列的90.81%与9311相同。检测到381403个SNPs,50116个InDels,1279个CNVs,10026个PAVs。





辐射突变的水稻的全基因组分析

2、在381403个SNPs中247054个是纯合型SNPs,11943个是同义SNPs,15265个是非同义SNPs。有314个SNP能导致翻译提前终止,130个SNP与内含子可变剪接有关,114个位于起始/终止密码子。


图1变异全局总览

3、检测到50116个InDels,25314个是插入,24802个是缺失。这些InDels位于6271个基因上。长度为1bp的InDel占75.61%,75.59%位于CDS区。大多为长度为1-,2-,4-,5-bp的InDels。此外,随着InDels长度的增加,含有InDels的基因数量也急剧减少。

4、检测到1279个CNVs及10026个PAVs,分别位于1503个、3644个基因上。

5、GO注释发现,在细胞组成这个ontology中,含有SNPs、InDels、SVs的比例分别为26.5%、35.2%、23.8%;分子功能ontology,结合和催化活性有较高的突变率;生物学过程中的代谢过程和细胞过程具有较高的突变率。



 结果展示 


1、SNP在基因组位置分布以及外显子区功能

根据样本基因组GFF注释文件,利用ANNOVAR软件的gene-basedannotation功能对过滤后的SNP进行注释,通过注释,可以确定 SNP 在基因组不同功能区域的分布,确定是否发生非同义突变,是否影响蛋白功能。

SNP在基因组位置分布

图3 SNP在基因组位置分布(左)和外显子区SNP功能(右)

 样本要求 

样品

具体要求

样品类型

无降解且无RNA污染的DNA样品

样品需求量

建议送样量:小片段文库≥2µg;

最低送样量:小片段文库≥1µg

构建多次(N次)文库所需DNA量:3×(N+1)µg

样品浓度

建议浓度:≥30ng/µl

最低浓度:≥10ng/µl

样品纯度

OD260/280=1.8~2.0


 常见问题 

1、突变位点过多,无法找到与性状对应的突变怎么办?

回答:用某个基因的差异表达作为过渡: 突变A-->B基因表达变化-->表型;

2、突变位点过少怎么处理?

回答:剪切位点创造有潜力的突变


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