环境微生物抗生素抗性基因ARGs检测
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1、技术简介

环境中抗生素抗性基因(AntibioticResistanceGenes, ARGs)的来源主要是环境中细菌的内在抗性基因及随人或动物粪便排到体外的抗性细菌。在医疗保健行业以及养殖业中抗生素的长期滥用,导致抗生素抗性基因快速出现和扩散。抗生素抗性基因作为一种新型的环境污染物,由于其固有的生物学特性,例如可在不同细菌间转移和传播甚至是自我扩增,可表现出独特的环境行为,其在环境中的持久性残留、传播和扩散比抗生素本身的危害还要大。抗生素抗性基因的研究在环境科学研究领域也日益受到关注。实时荧光定量PCR技术是目前监测环境抗性基因丰度的有力工具。该技术已被应用于不同环境中,包括养殖水域、污水处理厂、河流、沉积物和土壤等。

    抗生素抗性基因检测使用WafergenSmartchip超高通量荧光定量PCR系统完成,该系统每次能够并行5184个纳升级qPCR反应。实现快速准确地检测各类环境介质中ARGs的多样性和丰度信息。

2、技术路线                                                                                                                                

环境中抗生素抗性基因

3、分析内容

分析内容

1.原始数据处理;

2.检出ARGs信息统计;

3.检出ARGs丰度模式分析;

4.Circos关联性分析

4、方案设计

环境中抗生素抗性基因

5、项目周期

芯片数量

正常周期(天)

极致周期(天)

X≤3

13

10

每增加1张smartchip增加2天


案例解析

文章题目:Trophic Transferof Antibiotic Resistance Genes in a Soil Detritus

Food Chain

期刊:ENVIRONMENTALSCIENCE & TECHNOLOGY

发表年度:2019

研究内容及主要结论:

抗生素抗性基因(ARGs)的存在和传播引起了全球公众的广泛关注;然而,我们对arg在食物链中的扩散知之甚少。在此,我们以土壤拟南芥-捕食性螨(Hypoaspis aculeifer)模型食物链为实验对象,研究了ARGs在被人为肥料污染的土壤生态系统中的营养迁移。结果表明,土壤改良剂能显著提高土壤微生物群落中ARGs的含量。随着猎物共生菌群中ARGs的增加,也发现了掠食性螨的共生菌群中ARGs的增加,特别是三种高富集ARGs (blaSHV、fosX和aph6ia)。三种独特的ARGs通过猎物coll栓子(aac(6)-lb(akaaacA4)、yidY_mdtL和tolC)从粪肥处理后的土壤中转移到捕食性螨的微生物群落中。粪改质改变了捕食螨的组成和结构,降低了其体内微生物群落的多样性。我们进一步揭示了细菌群落和移动遗传元素是ARGs营养转移的两个重要驱动因素,而不仅仅是ARGs在样本中的分布。这些发现表明,ARGs的食物链传播对土壤生态系统中抗性基因传播的重要性可能被低估了。

结果:

抗生素抗性基因的表征:

抗生素抗性基因的表征

抗生素抗性基因的表征

抗生素抗性基因的表征

土壤,猎物箭毒螨和掠食性之间共享与独有的ARGs

土壤,猎物箭毒螨和掠食性之间共享与独有的ARGs

基于OTU的Bray - Curtis距离,主坐标分析(PCoA)描述了一个模型土壤食物链中猎物箭毒螨和掠食性螨的细菌群落分布模式

207个移动基因元件(MGEs)的相对丰度与抗生素抗性基因(ARGs)的线性回归

207个移动基因元件(MGEs)的相对丰度与抗生素抗性基因(ARGs)的线性回归

文章题目:Diverseand abundant antibiotic resistance genes in Chinese swine farms

作者:Yong-GuanZhu, Timothy A. Johnsonc et.al

发表期刊:PNAS

发表时间:2013年

材料选择:商业养猪场的粪肥

样本设计:中国不同地区(北京、江西、莆田)3个大规模养猪场的粪肥,取粪肥相关的3个阶段的样本:粪肥、堆肥、接收堆肥的土壤��另从莆田的原始森林中取得没有喂过抗生素的猪的粪肥和土壤作为实验对照。

                 每个地点取4个样本作为重复。

实验设计:1. 检测样本ARGs,使用经过验证的313对引物检测244个ARGs,在所有样本

中共检测到149种ARGs

          2、对这些样本的ARGs进行分类比较,分析样本差异

          3、对ARGs进行聚类分析

          4、分析ARGs与转座酶的相关性

结果:

(A) 所有样本都有富集,包括controlmanure (CM);(B) 所有养殖场样本均有富集,但是CM没有; (C) 广泛在养殖场样本中富集,但是CM中没有; (D)Genes在Putian compost中富集,但是Putian manure中没有;(E) 在CM and farm manures中富集程度很高的genes.

ARGs与样本聚类统计

ARGs与样本聚类统计

养殖场粪肥与对照粪肥作比较,养殖场堆肥、土壤与对照土壤作比较,得出不同区域样本ARGs富集关系。同时文章发现转座酶与ARGs一样被高度富集

ARGs和转座子丰度展示

ARGs和转座子丰度展示

转座酶在各样本中均有显著富集,粪肥样本是对照样本的90000倍,土壤样本是对照样本的1000倍。丰富的ARGs与转座酶的水平高度相关

ARGs与转座酶基因共线性分析


ARGs与转座酶基因共线性分析


结果展示

ARGs检出堆积统计图

ARGs检出堆积统计图

ARGs抵抗抗生素类别饼状图

ARGs抵抗抗生素类别饼状图

聚类热图(引物)

聚类热图(引物)

Circos关联分析图

Circos关联分析图


样本要求

基因组DNA,根据客户样本和引物数量,安排上机点样模式,总量要求在0.25-1.38μg之间,浓度>10ng/µL,具体见下表:

建库类型

模式

检测结果


Assay

Sample

总量

参考浓度

16S Ct

抗生素抗性基因检测

12

384

≥170.4ng

≥10ng/µL

≤17

24

216

≥178.8ng

36

144

≥187.2ng

48

108

≥198ng

54

96

≥202.8ng

72

72

≥216ng

80

64

≥223.2ng

96

54

≥235.2ng

120

42

≥258ng

144

36

≥273.6ng

216

24

≥489.6ng

248

20

≥525.6ng

296

16

≥892.8ng

384

12

≥979.2ng


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