真菌全基因组de novo测序
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真菌框架图

1、技术简介

利用二代高通量测序技术,对某一种未知基因组的真菌进行测序,对基因组进行初步组装,获得基因组序列和特征信息。

2、技术路线

真菌框架图

3、分析内容

基本数据质控

1. 基本数据过滤及统计;

2. 测序质量值分布

标准分析

1. Survey分析

1.1 基因组大小预估

1.2 杂合率和重复序列预估

1.3 K-mer分析

2 基因组组装

2.1 数据纠错

2.2 构建congtigs

2.3 构建scaffold

2.4 补洞

2.5 组装结果统计

2.6 组装结果评估

3. 基因组注释

3.1 基因结构预测

3.2 基因功能注释

4、方案设计

建库类型

DNA小片段文库

测序类型

NovaseqPE150测序

测序数据量建议

3-8G(根据近源物种基因组大小决定)

5、项目周期

建库测序周期20天

信息分析周期15天


样本数量

正常周期(天)

极致周期(天)

X≤10

35

30



真菌精细图


1、技术简介

利用Illumina二代测序+PacBio三代测序技术,评估菌株情况制定测序策略,测序后对基因组进行拼接组装,获得高质量基因组序列。

2、技术路线

真菌框架图

真菌框架图

3、分析内容

基本数据质控:

1. 基本数据过滤及统计;

2. 测序数据质量评估

标准分析:

1.基因预测

2.NR/Swiss-prot/Pfam注释

3.CAZy注释

4.KOG/GO/KEGG注释

5.基因组进化树构建

6.共线性分析

7.重复序列分析

8.基因簇比较作图

9.分泌蛋白分析

10.假基因预测

11.PHI分析

12.基因家族扩张与收缩分析

13.进化速率分析

4、方案设计

建库类型

DNA小片段文库

PacBio大片段文库

测序类型

NovaseqPE150测序

PacBio Sequel测序

测序数据量建议

~100X/sample

1-2 cell/sample

5、项目周期

样本数量

正常周期(天)

极致周期(天)

X≤5

55




真菌精细图

案例解析

文章题目:Genome sequence of the model medicinalmushroom Ganoderma lucidum

作者:ChenS, Xu J, Liu C, et al.

发表期刊:NatureCmmunications

发表时间:2012

背景介绍:

利用二代测序和opticalmapping光学图谱的方法对单倍体核细胞的灵芝菌株260125-1进行了全基因组测序和组装,获得了灵芝的全基因组图谱。

    组装得到的基因组大小约43.3Mb,预期编码了16,113个基因。序列分析揭示了一连串令人印象深刻的基因,这些基因编码了细胞色素P450s(CYPs)、转运蛋白和调节蛋白等协同参与次级代谢的蛋白质。该基因组还编码了在所有测序担子菌中最丰富的一套木材降解相关酶(wood degradation enzyme)。总共鉴别出了24个CYP基因簇。此外,发现了78个与羊毛固醇合酶共表达的CYP基因,16个CYP显示与可特异羟化睾酮(testosterone)的真菌CYPs具有高度相似性,表明它们可能在三萜系化合物生物合成中发挥了作用。

材料:单倍体阶段的灵芝

测序平台:Roche454 & Illumina GAII+光学图谱

测序方法:二代测序,共测序得到218M reads

结果:

样本选取单倍体阶段的灵芝,采用Roche 454和Illumina GAII测序,得到218M reads,组装得到82个scaffold,共定位到13个染色体范围的光学图谱上。

基因组Circos图

基因组Circos图

转录组测序,收集了3个阶段的样本,单核菌丝体(单倍体)、子实体原基,子实体。重构的转录本比对了到85%的预测灵芝基因上。3个阶段共表达了12,646个基因。从菌丝体到原基、原基到子实体的基因表达水平的范围很宽,在阶段转化的过程中,至少有4669个基因表达显著差异。

差异基因Venn图

差异基因Venn图

78个CYP基因,其中28个被分类到灵芝特有的新的基因家族中,另外38个被分类到之前一致的新的亚家族中。剩下的12个基因属于在P. chrysosporiumPostia placenta中也存在的亚家族中。在之前对于以上两个菌种CYP基因的研究中,了解到一些来自于CYP512和CYP5144家族的酶只高效的修饰一种动物甾类激素:睾酮。由于灵芝产生的睾酮和三萜类化合物的结构类似,所以推断15个CYP512基因和1个CYP5144基因和LSS共表达可能与三萜类化合物的生物合成相关。

系统发育树分析

系统发育树分析

为了展现于三萜类化合物生物合成相关的基因簇,文章检测了所有灵芝基因组上的CYP基因簇,发现了24个基因簇包含3个或更多的CYP基因。这些基因簇中,有2个含有与LSS共表达的CYP基因。然而在6号染色体上与LSS靠的很近的10个基因并没有与LSS表现出很强的共表达关系,说明还需要更深入的研究。

染色体CYP基因簇位置

染色体CYP基因簇位置

总结:

来自中国医学科学院药用植物研究所、美国田纳西州大学健康科学中心和威斯康星大学麦迪逊分校等机构的研究人员联合完成了灵芝(Ganoderma lucidum)的基因组框架图,发布在国际著名杂志《自然通讯》(NatureCommunications)上。这一研究为揭示中药活性成分生物合成的分子机制,加速优质、高产灵芝优良品种的选育奠定了坚实的基础。

    在文章中找出的这些基因组信息有助于阐明这一药用真菌中各种次级代谢物合成的分子机制。基因组序列使得有可能实现灵芝作为药理活性化合物和工业酶资源的全部潜在用途。



真菌框架图


结果展示

    

Read碱基质量分布图

SampleID

TotalLength(bp)

ScaffoldNumber

N50(bp)

N90(bp)

GC(%)

Bacteria

5,413,333

97

159,696

39,275

62.80

组装结果统计

17-mer深度分布图

GC含量及深度预测分布图

GC含量及深度预测分布图

GC含量及深度预测分布图



SampleID

TotalGene Length(bp)

GeneNumber

Average Length(bp)

Genome Coverage(%)

Bacteria

4,851,519

4,922

985

89.62

基因结构预测统计


真菌框架图


样本要求   

样品

具体要求

样品类型

基因组DNA

样品需求量

总量 ≥3μg

样品浓度

浓度 ≥20ng/μl

样品纯度

主带明显,没有降解,没有蛋白质污染


真菌精细图

本要

基因组DNA,总量≥35μg,浓度≥300ng/μL,OD260/280:1.8-2.0;D260/230:2.0-2.2;Qubit/OD>0.5

样品

具体要求

样品类型

基因组DNA

样品需求量

总量 ≥35μg

样品浓度

浓度 ≥300ng/μl

样品纯度

OD260/280:1.8-2.0;D260/230:2.0-2.2;Qubit/OD>0.5

无降解




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